Sulfuro de hidrógeno/Ácido sulfhídrico (H2S)
La producción de sulfuro de hidrógeno (H2S) constituye una importante preocupación y desafío en los sistemas acuícolas de recirculación (RAS), debido a las mortalidades agudas que se provocan.
Los niveles elevados de sulfuro de hidrógeno (H2S) pueden tener efectos letales en los peces.
La presencia de oxígeno actúa en contra de la producción de H2S, pero es un proceso muy lento que no puede proteger a los peces en situaciones con alzas repentinas de H2S.
Los ambientes anaeróbicos con H2S pueden formarse en cualquier lugar de una piscicultura, particularmente en biofiltros y sistemas de tuberías estancadas.
La concentración de sulfato (SO₄²-) es significativamente mayor en el agua de mar (2700 mg/L) en comparación con el agua dulce (5-50 mg/L).
Sin embargo, una piscicultura debe operar por debajo de 5 ppt de salinidad antes de que el SO₄²- se convierta en un factor limitante para la formación de H2S. Las bacterias reductoras de sulfato compiten con las bacterias reductoras de nitrato por los ácidos grasos volátiles.
Como resultado, si la piscicultura opera a un nivel más alto de nitrato, entonces las bacterias reductoras de nitrato pueden superar a las bacterias reductoras de sulfato para limitar los ácidos grasos volátiles.
Los peces son muy sensibles al H2S. Los niveles de incluso 2 µg/L en agua dulce y 5 µg/L en agua salada pueden causar estrés, y las concentraciones superiores a 25 µg/L pueden ser letales (Hamann H., 2020).
La razón por la que el H2S causa una alta mortalidad aguda en peces es consecuencia a su alta toxicidad, debido a que el H2S bloquea todos los sistemas enzimáticos que contienen hierro férrico, particularmente el complejo de enzimas respiratorias que contiene citocromo C oxidasa, lo que produce una falla en la reducción del oxígeno a nivel mitocondrial inhibiendo la producción de ATP.
El efecto tóxico del sulfuro de hidrógeno es el resultado de la depresión de la actividad del SNC, la mortalidad generalmente resulta por la anoxia del cerebro.
Se ha observado en alevines de Trucha marrón expuestos a concentraciones agudas de H2S (0,007 y 0,013 mg/l) comportamiento de inquietud, excitabilidad en el nado, movimientos operculares rápidos y presencia de boca abierta, seguida de periodos de letargo con disminución a estímulos mecánicos hasta llegar a la muerte.
Alevines expuestos a concentraciones crónicas no mostraron alteraciones severas de comportamiento y orientación, pero sí de aumento de movimientos operculares (Reynolds F., 1976).
Los efectos del H2S son más peligrosos a valores de pH bajos. Por el contrario, se vuelve menos peligroso a valores de pH más altos, donde existe mayormente en anión bisulfuro (HS–). El gas H2S se une al agua para formar HS–. A pH 7,5, se une alrededor del 75 %, mientras que a pH 7,0 solo se une el 50 % (ver gráfico 1).
Afortunadamente, hay una eliminación constante de H2S y HS– en las pisciculturas. HS– se une a los metales para formar sulfuros metálicos, el H2S se puede desgasificar, mientras que el ozono, el oxígeno y el nitrato oxidan el H2S a formas menos tóxicas (Boyd C., 2014).
Para las pisciculturas RAS, el objetivo debería ser no tener acumulación de H2S en absoluto, el cual se puede prevenir midiendo el sulfuro de hidrógeno de forma rutinaria varias veces al día, minimizar la caída de pH en los estanques, evaluar los niveles de turbidez para minimizar la creación de zonas anaeróbicas y mantención de biofiltros oxigenados (Rojas-Tirado et al., 2021).
Nitrito (NO2-)
El nitrito (NO2-) es un componente natural del ciclo del nitrógeno en el ecosistema y su presencia en el ambiente es un problema potencial debido a su toxicidad en animales.
Los animales acuáticos poseen un riesgo mayor de intoxicación que los terrestres debido a que en el ambiente acuático el NO2– puede ser absorbido activamente a través del epitelio branquial y puede acumularse en altas concentraciones en los fluidos corporales.
El nitrito corresponde a un producto intermedio de la oxidación del amonio a nitrato.
La concentración de nitrito en ambiente acuático natural es típicamente baja. Concentraciones elevadas pueden ser encontradas en efluentes conteniendo nitrógeno, ambientes hipóxicos o en efluentes industriales de metales, tinturas y celulosa.
Los métodos acuícolas intensivos utilizados hoy en día, principalmente sistemas RAS remueven el amonio del agua, sin embargo, existe el riesgo de una posible oxidación incompleta de amonio acompañada de una acumulación de nitrito en el sistema.
Tras el inicio del proceso de nitrificación en filtros biológicos, o durante un desequilibrio en el proceso, las concentraciones de nitrito pueden alcanzar niveles de 50 mg/L o más, esto podría resultar en mortalidades masivas.
Factores que afectan el proceso de nitrificación incluyen pH, temperatura, oxígeno disuelto, número (población) de bacterias nitrificantes y la presencia de componentes inhibitorios del proceso, tales como, ácido nitroso, NH3, azul de metileno, antibióticos y algunos componentes orgánicos (anilina, dodecilamina, p-nitrobenzaldehido).
Los problemas de nitrito en peces de agua dulce se originan por el hecho de que NO2– tiene afinidad por el mecanismo branquial de absorción de Cl-, presumiblemente por la vía de intercambio Cl-/HCO3-; por lo tanto, dondequiera que el nitrito esté presente en el ambiente acuático, una parte del ingreso de Cl- será cambiado por ingreso de NO2-.
La sangre aparece como el objetivo primario del nitrito.
Desde el plasma sanguíneo el NO2– difunde dentro de los glóbulos rojos, donde oxida el hierro en la hemoglobina al estado +3 de oxidación. La hemoglobina (Hb) que es cambiada de este modo se denomina metahemoglobina (metHb) o ferri hemoglobina, la cual carece de la capacidad de unirse al oxígeno de forma reversible.
La metahemoglobina reduce la capacidad total de transporte de oxígeno de la sangre. La metahemoglobina le da a la sangre una coloración café, por lo que una sinología visible asociada a altos niveles de metahemoglobina es la coloración café de la sangre y las branquias. En tilapia (Oreochromis niloticus) la sangre de coloración café se ha observado tan pronto como los niveles de metahemoglobina alcanzan alrededor de un 20% del total de Hb.
La cantidad de metahemoglobina necesaria para producir mortalidad, reducir el crecimiento, o alterar el comportamiento normal de los peces puede variar con la especie y las condiciones ambientales. Como regla general aproximada, concentraciones de metahemoglobina superiores a 50% son consideradas peligrosas para peces.
Mecanismos de detoxificación
Los glóbulos rojos contienen metahemoglobina-reductasa (metHb), una enzima que reconvierte la metahemoglobina a hemoglobina.
Esto ocurre continuamente y restaura la proporción normal de hemoglobina dentro de 24-72 horas si los peces son transferidos hacia aguas libres de nitrito. Como los peces son organismos poiquilotermos la eficiencia de la enzima metHb-reductasa puede variar de acuerdo con la temperatura del agua.
Los peces son también capaces de detoxificar el nitrito, oxidándolo a nitrato que es menos tóxico, mediante sistemas como la hemoglobina, catalasa y citocromo oxidasa. Una parte de la detoxificación toma lugar en el hígado, como se ha demostrado la habilidad de hepatocitos de trucha para oxidar nitrito a nitrato.
Eritrocitos oxigenados de trucha también demostraron tener la capacidad de detoxificar nitrito a nitrato, en cambio eritrocitos en condiciones anóxicas no tuvieron esa capacidad. Se han descrito varias moléculas redox de bajo peso molecular que reducen la toxicidad del nitrito, tales como, azul de metileno, ácido ascórbico, ácido úrico, ácido violúrico, ribosyl ácido úrico y glutatión.
El Nitrato, que es el producto final de los mecanismos de detoxificación, es posiblemente excretado vía orina y bilis.
Alteraciones fisiológicas
El nitrito tiene múltiples efectos fisiológicos. Una de las consecuencias críticas de la acumulación de nitrito es la oxidación de hemoglobina (Hb) a metahemoglobina (metHb), sin embargo, mortalidades asociadas a peces expuestos a nitrito han sido observadas con altos y bajos niveles de metahemoglobina, sugiriendo que la toxicidad del nitrito puede estar conectada también con otros efectos.
Como consecuencia de las condiciones hipóxicas causadas por la metahemoglobina se podría producir daño en varios órganos como el hígado o la retina.
Hipoxia en los tejidos y producción anaeróbica de energía puede ser evidenciada con niveles elevados de lactato plasmático. El nitrito también induce alteraciones a nivel de mitocondrias y lisosomas.
El estado general de baja disponibilidad de oxígeno eventualmente lleva a un comportamiento de “boqueo” de los peces intoxicados con nitrito, induciendo una significativa hiperventilación.
A la histología Svobodova et al., (2005) observaron a nivel branquial hiperplasia, vacuolización y Elevado número de células de cloro en carpas intoxicadas con nitrito. Michael et al., (1987) observaron hiperplasia e hipertrofia en branquias de Clarias lazera expuestos de forma crónica a nitrito.
El nitrito influye críticamente en el balance de potasio, elevando significativamente el K+ extracelular en carpa. El aumento extracelular de K+ proviene de la pérdida desde los eritrocitos y músculo esquelético como se describe en estudios en trucha y carpa. El aumento de K+ puede afectar la contracción del corazón llevando a una falla cardíaca.
El eflujo de K+ desde los eritrocitos produce una pérdida de agua de la célula y, por lo tanto, generando un encogimiento (“shrinkage”) de los glóbulos rojos. Este encogimiento usualmente es seguido de una pérdida de solubilidad de la hemoglobina, resultando en cristales de Hb y daño estructural del eritrocito.
Además, la alta actividad de la enzima metHb-reductasa durante la exposición a nitrito resulta en un alto costo metabólico para el eritrocito, acortándose la vida media de estas células. Estas alteraciones son seguidas por un aumento en el hematocrito, conteo de eritrocitos y concentración de hemoglobina.
Sangre de carpas expuestas a nitrito mostraron significativamente un mayor número de eritrocitos elongados con su núcleo localizado en uno de los polos de la célula, con presencia de un citoplasma marcadamente más pálido comparado con el grupo control.
La presencia de concentraciones subletales de nitrito promueve la presentación de enfermedades infecciosas en peces.
Calidad de Agua
Es conocido que la toxicidad del nitrito depende en gran medida de la salinidad del agua en la que se produce la exposición.
Mortalidades en agua de mar ocurren a concentraciones de nitrito entre 50 a 100 veces más altas que en agua dulce. Es de gran relevancia monitorear el ratio Cl-/N- NO2– en acuicultura (ver tabla 1).
El mecanismo de absorción de cloruro en las branquias tiene una mayor afinidad por cloruro que por nitrito, lo cual lo hace comportarse como un competidor-inhibidor, por lo tanto, incluso niveles moderados de sales (preferiblemente de cloruro) en el agua reducen de forma importante la entrada de nitrito y de su efecto tóxico (ver gráfico 2).
Otro anión que inhibe la toxicidad del nitrito es el Bromuro.
Capacidad Diagnóstica
VeHiCe cuenta con la capacidad de diagnosticar cuadros de toxicidad mediante el análisis histológico H&E (caracterizando los cambios celulares); uso de marcadores fisiológicos específicos; hematología diferencial mediante la caracterización morfológica de los eritrocitos como biomarcadores; bioquímica sanguínea para evaluar funcionalidad de órganos internos; entre otros.
La expertise a nivel histológico del equipo de patólogos en cuadros de intoxicación, sumado a la ayuda de análisis específicos enfocados en toxicología, entregan la capacidad de llegar a diagnósticos consistentes, que facilitan la asociación de los cuadros clínicos a los agentes causales involucrados. Adicionalmente, el departamento de I+D de VeHiCe se encuentra desarrollando, entre otras, técnicas enfocadas en la detección específica de intoxicaciones por H2S y NO2– en peces.
Referencias
Black K., Ezzi I.A., Kiemer M., and Wallace A. (1994). Preliminary evaluation of the effects of long-term periodic sublethal exposure to hydrogen sulphide on the health of Atlantic salmon (Salmo salar L). J. Appl. Ichthyol. 10, 362-367.
Boyd C. (2014). Hydrogen Sulfide Toxic, But Manageable. Sustainable aquaculture practices, 34-36.
Ciji A., and Shahbaz M. (2018). Nitrite implications and its management strategies in aquaculture: a review. Reviews in aquaculture, 1-31.
Hamann H. (2020). Solving the problem of hydrogen sulfide on a fish farm. Innovation news network (
Kroupova H., Machova J., and Svobodova Z. (2005). Nitrite influence on fish: a review. Vet. Med. – Czech. 50, 461-471.
Michael M.I., Hilmy A.M., el-Domiaty N.A., Wershana K. (1987): Serum transaminases activity and histopathological changes in Clarias lazera chronically exposed to nitrite. Comparative Biochemistry and Physiology C, 86, 255–262.
Reynolds F. (1976). The Effects of Long-Term Exposure to Low Concentrations of Hydrogen Sulfide on Brown Trout, Salmo trutta. Environmental Science and Ecology Theses. 12.
Rojas-Tirado P., Aalto S., Aatland A., and Letelier-Gordo C (2021). Biofilters are potential hotspots for H2S production in brackish and marine water RAS. Aquaculture. 536 (736490).
Svobodova Z., Machova J., Poleszczuk G., Huda J., Hamackova J., Kroupova H. (2005): Nitrite poisoning of fish in aquaculture facilities with water-recirculating systems: three case studies. Acta Veterinaria Brno, 74, 129–137.
William M., Lewis Jr., and Morris D. (1986). Toxicity of Nitrite to fish: a review. Transactions of the americen fisheries society. 115, 183-195.
